Александр Лукич Птушко родился 19 апреля 1900 года в Луганске в семье крестьян Луки Артемьевича и Натальи Семёновны Птушкиных.
Учился в реальном училище. С 1919 года служил в 11 кавалерийской дивизии 1 Конной армии. После Гражданской войны работал актёром и художником-декоратором в местном Народном доме (ныне Луганский областной дворец культуры), корреспондентом газеты «Донецкая кочегарка».
В 1923-1926 годах учился в Московском институте народного хозяйства. Сменил несколько профессий (корреспондент в газете, актёр, художник-декоратор), пока не нашёл своё призвание в кинематографе.
С 1927 года работал как художник-мультипликатор, режиссёр мультфильмов и конструктор кукол для мультипликации на киностудии «Мосфильм». В 1928 году дебютировал в качестве режиссёра, поставив серию мультфильмов с участием кукольного персонажа Братишкина, который позже также стал героем и рисованных мультфильмов.
В 1932 году Птушко снял первый звуковой объёмно-мультипликационный фильм «Властелин быта». Наиболее значительной его работой в 1930-е годы стал полнометражный мультипликационно-игровой фильм «Новый Гулливер» (1935), поставленный по мотивам романа Джонатана Свифта, в котором, наряду с 1500 куклами, играли живые актёры, были применены многие новаторские методы комбинированных съёмок. Возглавив художественно-производственное объединение объёмной мультипликации на «Мосфильме», Птушко поставил здесь фильмы «Сказка о рыбаке и рыбке», «Весёлые музыканты» и другие. В 1939 году вышел ещё один его мультипликационно-игровой фильм «Золотой ключик», снятый по сказке А.Н. Толстого.
Во время Великой Отечественной войны работал на ЦОКС в Алма-Ате, руководил трюковыми и комбинированными съёмками в фильмах «Парень из нашего города», «Секретарь райкома», «Зоя» и других.
В 1944-1946 годах – директор киностудии «Союзмультфильм». С 1960 по 1963 год – художественный руководитель Творческого объединения «Юность» детских и юношеских фильмов при киностудии «Мосфильм».
После войны Птушко начал снимать игровые фильмы, экранизируя былины, народные сказки, произведения русской литературы — «Каменный цветок» (1946), «Садко» (1952), «Илья Муромец» (первый советский широкоэкранный фильм со стереозвуком, 1958), «Алые паруса» (1961), «Сказка о потерянном времени» (1964), «Сказка о царе Салтане», (1968), «Руслан и Людмила» (1972). Также мечтал экранизировать «Слово о полку Игореве», и даже написал сценарий к будущему фильму, но из-за тяжёлой болезни и скоропостижной смерти не успел довести замысел до конца.
Птушко был также автором и соавтором сценариев, режиссёром комбинированных съёмок к ряду своих фильмов и фильмов других режиссёров.
Преподавал во ВГИКе. В 1932-1949 годах – и. о. профессора ВГИКа, заведующий кафедрой художественного факультета.
Написал ряд научно-популярных книг на тему мультипликации, трюковых и комбинированных съёмок.
Был несколько раз женат. Дочь от первого брака — Наталия Птушко (1926– 2008), работала ассистентом и вторым режиссёром на киностудии «Мосфильм», в том числе в картинах отца.
Александр Лукич Птушко умер 6 марта 1973 года в Москве. Похоронен на Новодевичьем кладбище (участок № 7).